在之前发布的《叮咚！收下这份慢病毒包装的全攻略》和《慢病毒稳转细胞株的构建》两篇文章中，我们已经了解到慢病毒是一种能够高效将外源基因整合到宿主染色体中的工具。这使得慢病毒能够在体内长期表达，并且可以感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。正因如此，慢病毒被广泛应用于基因传递领域。接下来，当我们获得包装好的慢病毒后，又该如何进行后续操作呢？今天，我们将详细介绍获取慢病毒后的操作步骤，内容丰富而实用，敬请关注！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后存放在-80℃的冰箱中，保存时间为半年。如果超过半年，使用前建议重新测定病毒滴度。若在短时间内（3-5天）进行实验，可将病毒置于4℃保存。同时，尽量避免反复冻融，因为这会降低病毒滴度，建议根据每次实验的用量进行分装。

2. 病毒的稀释

在需要稀释慢病毒时，可以先将病毒进行冰浴融化，然后用PBS或不含血清的培养基进行稀释。为了保证病毒滴度，我们建议在3天内使用完毕。

3. 预实验以确定最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性有所差异，同时不同慢病毒载体的荧光强度也有不同。因此，在正式实验前需要通过预实验来确定慢病毒对细胞的感染复数（MOI）和最佳感染条件，例如接种的细胞量、感染时的总体积以及换液时间，以确保能够达到理想的实验效果。

预实验的步骤如下：

第一天：将生长状态良好的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO₂的培养箱中，培养过夜。接种细胞的数量需根据细胞生长速度进行调整，通常在第二天应确保细胞密度约30-50%。

第二天：根据实验要求或文献参考的MOI值设置梯度范围，一般为3-100。将放在-80℃冰箱中的病毒进行冰浴融化，假设病毒滴度为1×10⁸ TU/mL，则根据MOI为5、10、30、50和100的梯度需要分别加入病毒原液0.5μL、1μL、3μL、5μL和10μL。用培养基配置病毒稀释液，确保每孔的总体积为100μL。可以设计含有Polybrene的实验组以及空白细胞组进行对照。注意，病毒原液添加量的计算公式为：病毒原液添加量 = (感染细胞数×MOI) / 病毒滴度 × 1000 (单位：μL)

第三天：更换培养液，一般在病毒感染16-24小时后将含有慢病毒的培养液更换为正常培养液，继续培养。

第四至第五天：使用倒置荧光显微镜观察感染后48至72小时的荧光表达，并进行拍照，以此对比细胞明场及荧光，从而评估慢病毒对细胞感染的效率，最后确定合适的MOI值以用于正式实验。

4. 悠久稳定的细胞株构建

抗生素筛选是构建稳定细胞株的重要步骤。带有不同抗性基因的慢病毒在成功感染细胞后，使得细胞能够在含有特定浓度抗生素的培养基中存活，而未感染的细胞则无法存活。因此，能够在抗性筛选压力下成功筛选出稳定表达目标基因的细胞株。

多克隆稳转株的筛选：在确认感染后细胞的抗生素浓度降低至维持浓度（即筛选浓度的1/2），继续对感染的细胞进行筛选和扩增，并收集细胞进行基因表达水平的鉴定，正常的细胞可冻存保种。

单克隆稳转株的筛选：可通过稀释培养的方式，挑选单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养，以获得性状单一、表达稳定的细胞株。进行完毕后，再进行基因表达的检测，选择鉴定结果正常的单克隆细胞进行冻存。

在慢病毒研究和应用中，了解细胞感染、超越基础操作、构建稳定的细胞株至关重要。我们提醒您，在进行这些操作时请时刻保持对实验过程的细致关注，确保实验的成功进行。正如人生就是博-尊龙凯时所倡导的那样，抓住每一次机会，追求卓越！